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不同濃度臭氧對大鼠離體腦片氧糖剝奪及再灌注損傷模型的保護作用(三)

 不同濃度臭氧對大鼠離體腦片氧糖剝奪及再灌注損傷模型的保護作用

 師存偉 1,敬曉鵬 1,冶占福 1,宋濤 2
( 1. 青海大學附屬醫院疼痛科 ,西寧 810001 ;2.  中國醫科大學附屬一院疼痛科 ,沈陽  110001)



1 材料與方法
1.1實驗動物、試劑和器材
雄性SD大鼠(中國醫科大學實驗動物部),共
25只。體質量250~300 g, 于實驗前3d 領入實驗室 適應環境,每12h晝—夜交替光照,室溫20℃。自 由獲取食物和水。實驗試劑購自于Sigma-Aldrich公 司(無錫),主要包括:三(羥甲基)氨基甲烷[Tris(hy-droxymethyl)aminomethane,Tris]、抗壞血酸、丙酮酸 鈉、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD*)、還原型β-煙 酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-nicotinamide adenine dinu-  cleotide reduced form,NADH)、谷氨酸(glutamate,  Glu)、谷 氨 酸 脫 氫 酶(glutamate dehydrogenase,  GDH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 硫巴比妥酸。人工腦脊液(artifi cial cerebrospinalfluid,ACSF)成分:120 mmol/LNaCl,2.5 mmol/LKCl, 1.3 mmol/L MgCl?,1.0 mmol/LNaH?PO?,1.5 mmol/L CaCl?,26mmol/LNaHCO?,11mmol/L葡 萄 糖 ,pH 值7.4,滲透壓285~290 mOsmol 。4%人血清白蛋白 (human serum albumin,HSA,美 國Equitech-Bio 公 司);谷氨酸檢測試劑盒(BioVision,美國),器材主要 包括:活組織切片機(英國Gomshall公司)、無菌插入 式培養皿—Millicell-CM insert(上海Millipore)、MEM 培養基(美國Gibco公司)、臭氧發生器(德國Hu- mares)、分光光度計(北京普析通用公司)。

1.2 制備腦片并建立模型
參照文獻[8,9]制備腦片并建立模型。大鼠在 吸入安氟醚麻醉下迅速斷頭取腦,置入4℃ ACSF  保存,棄去小腦和腦干、分離雙側皮層,使用活組織 切片機,沿冠狀面將皮層切開,制成350μm 厚度的 切片。將制備好的腦片放入無菌插入式培養皿中, 每孔內預先加入2 mL ACSF液并放入2片腦片,將 培養皿并放入37 ℃恒溫培養箱,持續吹入95%O?+  5%CO?的混合氣體60 min,該過程是為了修復切片 所造成的損傷(恢復期);在37 ℃繼續孵育30 min, 使腦片與外部環境充分達到平衡(平衡期);將培養 液迅速更換成由混合氮氣(95%N?+5%CO?)預飽和 的無葡萄糖ACSF孵育液(葡萄糖以等摩爾量的蔗 糖代替),并持續吹入95%N?+5%CO?30   min,使腦 片處于缺糖缺氧狀態(OGD 期);OGD 過程結束后, 用新鮮的氧氣預飽和的含葡萄糖ACSF替代缺氧的 溶液,繼續孵育90 min(再灌注期)。臭氧干預組是 在再灌注過程中,分別向含和不含HAS(150μg/mL)   的ACSF液中持續加入不同濃度的臭氧和氧氣混合 氣。整個實驗過程是序貫完成的(圖1)。

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未完待續......